動物細(xì)胞的離體培養(yǎng)一直是科學(xué)家們十分重視的研究領(lǐng)域。從1907年美國人Harrison將蝌蚪的神經(jīng)組織體外培養(yǎng)成功以后的近一個世紀(jì)里,動物細(xì)胞培養(yǎng)在動物病毒研究及疫苗生產(chǎn)中起了非常重要的作用。通過動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng),得到了許多極有價值的生物物質(zhì),如疫苗、診斷試劑、干擾素和單克隆體等,為人類的健康提供了有利的保障。20世紀(jì)80年代后期“組織工程”概念的提出,動物細(xì)胞的三維培養(yǎng)又成為了一個重要的研究課題,它使科學(xué)家們夢寐以求的目標(biāo)即體外重建人體組織逐步成為可能。

 

    動物細(xì)胞的培養(yǎng)大致有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)等方式。在動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中,細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是整個過程的關(guān)鍵設(shè)備,它要為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。按照動物細(xì)胞的生長要求,具備低的剪切效應(yīng)、較好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)是這類反應(yīng)器設(shè)計或改進(jìn)所必須遵循的原則。

 

    1 攪拌式生物反應(yīng)器

 

    攪拌式反應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力,它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性,因此在生物反應(yīng)中被廣泛使用。但由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù),因此對剪切作用十分敏感,直接的機(jī)械攪拌很容易對其造成損害,傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作動物細(xì)胞的培養(yǎng)顯然是不合適的。所以,動物細(xì)胞培養(yǎng)中的攪拌式反應(yīng)器都是經(jīng)過改進(jìn)的,包括改進(jìn)供氧方式、攪拌槳的形式及在反應(yīng)器內(nèi)加裝輔件等。

 

    1.1 供氧方式的改進(jìn)

 

    一般情況下,攪拌式反應(yīng)器還常伴有鼓泡,為細(xì)胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪切也很敏感,所以人們在供氧方式的改進(jìn)上做了許多工作。

 

    籠式供氧(cageaeration)是攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器供氧方式的一種,即氣泡用絲網(wǎng)隔開,不與細(xì)胞直接接觸。反應(yīng)器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力,以滿足細(xì)胞生長的要求。北野昭一報道了一個經(jīng)過改進(jìn)的攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器,整體呈梨形,攪拌置于反應(yīng)器底部,在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)內(nèi)側(cè)鼓泡,絲網(wǎng)外側(cè)的細(xì)胞不與氣泡直接接觸。

 

    Gelligen反應(yīng)器是美國NBS公司(NewBrunswick Scientific Co.)生產(chǎn)的適合于微載體系統(tǒng)的細(xì)胞反應(yīng)器。反應(yīng)器中有一個中空的導(dǎo)向攪拌槳,培養(yǎng)液和細(xì)胞通過中空導(dǎo)向槳形成上下循環(huán)。反應(yīng)器采用籠式供氧,溶于液體中的氧依靠絲網(wǎng)外液體的對流作用均勻分布到反應(yīng)器內(nèi)。該反應(yīng)器還帶有一個氣體調(diào)節(jié)系統(tǒng),用來控制溶氧濃度和pH值。由于氣泡不與細(xì)胞直接接觸,所以通氣量不受限制,而且泡沫少不需用消泡劑,細(xì)胞在循環(huán)過程受到的剪切力也很小。華東理工大學(xué)生化工程研究所開發(fā)的CellCul-20動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,主要工作原理與Gelligen反應(yīng)器相似,但采用了雙層籠式供氧,提高了氧的傳遞系數(shù)。在20L的反應(yīng)器中采用灌流工藝培養(yǎng)Vero細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)5天細(xì)胞數(shù)增加37倍,密度超過1×107個/mL。

 

    還有其他一些改進(jìn)的供氧方式。Lavery等用一個帶有雙層攪拌的反應(yīng)器測量了動物細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中氧的傳遞。攪拌軸是中空的,氣體從軸的底部通入,經(jīng)下層槳葉攪拌,均勻地分散于液體中：上層槳葉抑制了液面處氣泡的迸濺,從而減小了對細(xì)胞的損害。

 

    Sucker等介紹了一種帶攪拌的鼓泡反應(yīng)器,能在動物細(xì)胞的培養(yǎng)中將氣泡對細(xì)胞的損害降到最小。反應(yīng)器中央液面下方有一個氣液混合管,里面裝有鼓泡器和攪拌器。液體與鼓泡器出來的氣體在混合管內(nèi)逆流混合,然后在攪拌槳的作用下流出混合管在反應(yīng)器內(nèi)形成循環(huán)。他們設(shè)計了3種不同形式的混合管,目的是為保證混合管內(nèi)的氣泡只能浮于管口而盡可能不進(jìn)入培養(yǎng)液。實驗中在2.4L反應(yīng)器中的培養(yǎng)效果與100mL的spinner瓶相近。

 

    1.2 攪拌槳的改進(jìn)

 

    攪拌槳的形式對細(xì)胞生長的影響非常大,這方面的改進(jìn)主要考慮如何減小細(xì)胞所受的剪切力。Kaman等對攪拌槳的形式作了改進(jìn),并在反應(yīng)器內(nèi)加裝了輔件，實驗證明改進(jìn)后的反應(yīng)器適用于對剪切力敏感的細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)。反應(yīng)器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳(helicalribbon impeller),頂部的法蘭蓋上安裝了3塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為30°,垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個反應(yīng)器維持了較小的剪切力,實驗中用于昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng),最終的培養(yǎng)密度達(dá)到6×106個/mL,成活率在98%以上。

 

    2 非攪拌式生物反應(yīng)器

 

    攪拌式生物反應(yīng)器用于動物細(xì)胞培養(yǎng)存在的最大缺點(diǎn)是剪切力大,容易損傷細(xì)胞,雖然經(jīng)過各種改進(jìn),這個問題仍很難避免。相比之下,非攪拌式反應(yīng)器產(chǎn)生的剪切力較小,在動物細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢。

 

    2.1 填充床反應(yīng)器

 

    填充床(packed bed)是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物,供細(xì)胞貼壁生長。營養(yǎng)液通過循環(huán)灌流的方式提供,并可在循環(huán)過程中不斷補(bǔ)充。細(xì)胞生長所需的氧分也可以在反應(yīng)器外通過循環(huán)的營養(yǎng)液攜帶,因而不會有氣泡傷及細(xì)胞。這類反應(yīng)器剪切力小,適合細(xì)胞高密度生長。

 

    Park等人在由填充床反應(yīng)器和外循環(huán)裝置構(gòu)成的連續(xù)流動的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)動物細(xì)胞。反應(yīng)器中的填料是帶有微孔的陶瓷珠粒,細(xì)胞在微孔內(nèi)生長,同時培養(yǎng)液也可以在孔內(nèi)擴(kuò)散。實驗證明該反應(yīng)器適于動物細(xì)胞的高密度培養(yǎng),細(xì)胞終期密度達(dá)到了5×108個/mL。

 

    Chiou等人在以聚氨酯和纖維素泡沫為填料的填充床反應(yīng)器中培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞,證明這兩種微孔材料適合昆蟲細(xì)胞的生長且不易脫落。在兩類填充床中高密度培養(yǎng)的細(xì)胞其最終平均密度達(dá)到了4.3×107和5.2×107個/mL。

 

    John等在以玻璃纖維作環(huán)形填料的氣升式填充床反應(yīng)器中模仿鼠類骨髓細(xì)胞生長環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞,證明這類反應(yīng)器可以用于動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。Cong等人用微載體培養(yǎng)提供種子細(xì)胞,也在填充床反應(yīng)器中成功實現(xiàn)了CHO細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng),最大細(xì)胞密度達(dá)到了2×107個/mL。

 

    2.2 中空纖維反應(yīng)器

 

    中空纖維反應(yīng)器(hollow fiber bioreactor)由于剪切力小而廣泛用于動物細(xì)胞的培養(yǎng)。這類反應(yīng)器由中空纖維管組成,每根中空纖維管的內(nèi)徑約為200μm,壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2等小分子可以自由透過膜擴(kuò)散,動物細(xì)胞貼附在中空纖維管外壁生長，可以很方便地獲取氧分。

 

    John等報道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的徑向流中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器內(nèi)有一個垂直的中央分配管,外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床,細(xì)胞在中空纖維外壁貼附并生長?？諝夂虲O2的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層,向細(xì)胞提供氧分并維持一定的pH值環(huán)境,細(xì)胞的代射物隨氣流帶出。在這個反應(yīng)器中細(xì)胞生長的表面密度可達(dá)7.3×106個/cm2。

 

    Guinn發(fā)明了一個可用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)裝置,由中空纖維反應(yīng)器和灌流系統(tǒng)組成。液體通過泵在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)循環(huán),灌流系統(tǒng)補(bǔ)充或置換培養(yǎng)介質(zhì)及移出代謝物。細(xì)胞在中空纖維膜的一側(cè)生長,培養(yǎng)介質(zhì)在膜的另一側(cè)通過擴(kuò)散向細(xì)胞傳遞營養(yǎng)。該反應(yīng)器能為細(xì)胞提供一個溫和的生長環(huán)境。

 

    Gebhard的發(fā)明也是一個用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器,用泵控制培養(yǎng)介質(zhì)在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)。培養(yǎng)液在中空纖維腔內(nèi)流動并通過中空纖維膜向另一側(cè)供應(yīng)細(xì)胞生長所需的養(yǎng)分。該反應(yīng)器可控制溶氧、介質(zhì)組成、溫度和pH值,適合于細(xì)胞的高密度懸浮培養(yǎng),尤其適合于動物細(xì)胞。

 

    Gramer介紹了小型的中空纖維動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,由氧滲透膜管和中空纖維束構(gòu)成內(nèi)外空間,供細(xì)胞生長和向細(xì)胞提供營養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)密度幾乎能達(dá)到2×108個/mL。該反應(yīng)器可用于為大規(guī)模中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)預(yù)測不同介質(zhì)、培養(yǎng)條件及其他因素對細(xì)胞生長可能產(chǎn)生的影響。

 

    2.3 氣升式生物反應(yīng)器

 

    氣升式生物反應(yīng)器(airlift bioreactor)也是實現(xiàn)動物細(xì)胞高密度培養(yǎng)的常用設(shè)備之一,其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡單,操作方便。戴曉萍等人在氣升式反應(yīng)器中利用微載體培養(yǎng)技術(shù),研究了Vero細(xì)胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應(yīng)器中懸浮微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞,在加入適量保護(hù)劑、營養(yǎng)供應(yīng)充足的情況下,細(xì)胞可以正常生長至長滿微載體表面,終密度可達(dá)1.13×106個/mL。

 

    香港大學(xué)的Wen等人報道了一個新型的灌流裝置,由氣升式反應(yīng)器和澄清器組成,用于高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞。在灌流循環(huán)中,細(xì)胞經(jīng)過兩級沉降回到反應(yīng)器,平均培養(yǎng)密度達(dá)到了1.31×107個/mL。

 

    3 其他類型的反應(yīng)器

 

    除上述類型的反應(yīng)器外,一些其他類型的適于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器也時有報道。

 

    Kleis等人設(shè)計了一個“粘性泵生物反應(yīng)器”(viscous pump bioreactor),它以“三維流動”代替攪拌混合,提供較高的傳質(zhì)速率。反應(yīng)器的底部是提供動力的流線型轉(zhuǎn)盤,培養(yǎng)液在反應(yīng)器中以水平運(yùn)動和螺旋的縱向運(yùn)動形成“三維流動”。由于轉(zhuǎn)盤和反應(yīng)器頂部都為流線型而沒有鋒利的邊緣,所以產(chǎn)生的剪切力很小。

 

    一篇美國專利介紹了一種膜式旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)器,由一個培養(yǎng)室和一個供應(yīng)室組成,中間隔有一層半透膜。營養(yǎng)物可以從供應(yīng)室透過膜進(jìn)入培養(yǎng)室,細(xì)胞代謝物也可以通過膜進(jìn)入供應(yīng)室。培養(yǎng)器中的混合裝置在培養(yǎng)器旋轉(zhuǎn)時保證細(xì)胞在培養(yǎng)室中溫和混合并穩(wěn)定懸浮。培養(yǎng)室與氧源之間的氣體滲透膜使氧分能透過膜擴(kuò)散溶于液相。該裝置產(chǎn)生的剪切力很小,適合于細(xì)胞高密度地培養(yǎng)。另一篇美國專利介紹了一個組合式細(xì)胞培養(yǎng)器,帶有膜的培養(yǎng)室插在供應(yīng)室中,通過定位裝置可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)室的位置。該培養(yǎng)器適合于細(xì)胞或組織的培養(yǎng)。

 

    Tsao發(fā)明了一個帶有拱形培養(yǎng)室的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,空氣不與細(xì)胞直接接觸,氧分通過氣體滲透膜向培養(yǎng)介質(zhì)中溶解。培養(yǎng)室可以繞軸旋轉(zhuǎn),拱形的結(jié)構(gòu)減小了對細(xì)胞的剪切,尤其適合于動物細(xì)胞的培養(yǎng)。

 

    陶祖萊等人發(fā)明了一個用于組織工程的雙軸旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞/組織三維培養(yǎng)器,由內(nèi)筒培養(yǎng)液流動室、細(xì)胞培養(yǎng)室和外筒氣室的3個套筒組成,有利于細(xì)胞和組織三維生長及O2、CO2、營養(yǎng)物和代謝物的傳遞。他們還發(fā)明了一種可調(diào)控應(yīng)力的旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞/組織三維培養(yǎng)器,也是三套筒結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)器內(nèi)剪應(yīng)力隨著細(xì)胞聚集體的形成,可以從零調(diào)控至培養(yǎng)細(xì)胞或組織的生物應(yīng)力。

 

    Saha報道了一個新型的動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器(“see-saw” bioreactor)。反應(yīng)器由兩個獨(dú)立的筒狀培養(yǎng)室構(gòu)成,底部用管路聯(lián)通。通過培養(yǎng)室頂部的三通閥在壓縮和放空間切換,培養(yǎng)液在培養(yǎng)室間作類似“拉鋸”的運(yùn)動。由于粘性的作用,液面下降時液體在器壁上拉伸成膜,增大了與空氣的接觸面積,有利于氧的傳遞。實驗在3種切換時間下(20s、25s、30s),溶解氧的實測值均比理論濃度高。反應(yīng)器中沒有攪拌和鼓泡的作用，所以對細(xì)胞的損傷很少。

 

    此外,脈沖式生物反應(yīng)器(pulsatile bioreactor)也是用在組織培養(yǎng)中的一種新型反應(yīng)器。營養(yǎng)液通過脈沖灌流進(jìn)入反應(yīng)器,脈沖的頻率和強(qiáng)度可調(diào),借以模擬動物體內(nèi)的生物應(yīng)力。

 

    4 結(jié)語

 

    動物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,上面所介紹的幾類都有各自的特點(diǎn)。但不論是改進(jìn)的還是新型的,主要解決的共性問題都是要按照動物細(xì)胞的生長要求,使反應(yīng)器具備低的剪切效應(yīng)、良好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)。但在實際過程中,這些原則總有一些相互制約的因素,為了強(qiáng)化傳遞效果需要有一個充分的混合環(huán)境(包括氣體鼓泡),但動物細(xì)胞的脆弱性制約了這個環(huán)境的形成;為提高培養(yǎng)介質(zhì)中的溶氧度需要有較高的氧分壓,不過,高的氧分壓也影響了代謝物的移出。同時,過高的氧分壓也影響細(xì)胞的正常生長。如何優(yōu)化這些制約,是這類反應(yīng)器開發(fā)中要解決的問題。在動物細(xì)胞培養(yǎng)中,反應(yīng)器的改進(jìn)大多針對攪拌式反應(yīng)器。雖然這類反應(yīng)器剪切力大,但由于它混合均勻、結(jié)構(gòu)簡單、操作方便以及良好的傳遞效果和操作彈性,在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中仍占有重要的位置。

 

    目前,研究工作要致力于開發(fā)高密度細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,提高細(xì)胞生產(chǎn)率或生物產(chǎn)物的濃度。尤其組織工程的迅速發(fā)展,對動物細(xì)胞生物反應(yīng)器有了不同要求。要保持細(xì)胞離體培養(yǎng)時能具有同體內(nèi)一樣的三維異性結(jié)構(gòu)、維持分化細(xì)胞的功能并支持細(xì)胞的高密度生長,培養(yǎng)過程要考慮種植有細(xì)胞的三維基質(zhì)支架和生物反應(yīng)器所組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。事實上,一種反應(yīng)器的開發(fā)不可能滿足動物細(xì)胞生長的所有要求,同時也不可能適合所有的細(xì)胞培養(yǎng)方式。所以,根據(jù)某種細(xì)胞的培養(yǎng)過程或細(xì)胞的某種培養(yǎng)方式,開發(fā)專用反應(yīng)器也許會比通用反應(yīng)器有更好的效果。

 

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